雌性激素是具有广泛生物活性的甾体类固醇物质，雌激素的正常分泌，对于人体有重要作用。雌性激素不仅具有促进和维持女性生殖器官和第二性征的生理作用，而且具有滋润皮肤、促进毛发生长、促使乳房发育和增大的作用。目前，市面上有大量的保健食品宣称有祛斑、提高皮肤水分等美容功效，但常用的保健食品原材料难以在短时间内达到理想的美容效果，为了快速起效，不法商贩很可能在其中添加雌性激素。由于激素类物质在极低浓度下具有较强的内分泌干扰作用，过量的雌性激素可引起色素沉着，产生黑斑，内分泌紊乱和潜在的致癌性。相关的研究报道对该类激素检测方法主要有高效液相色谱法 (HPLC)、气相色谱 – 质谱联用法（GC–MS）、液相色谱 – 质谱联用法(HPLC–MS)、超高效液相色谱 – 串联四级杆质谱 法 (UPLC–MS／MS)等。 由 于 雌 性 激 素 具有极性较弱，熔点高，不易气化等性质，采用气相色谱 – 质谱法分析时，样品需要衍生化处理，操作繁琐，重现性差；液相色谱法检测灵敏度较低；而且这些方法普遍存在检测组分种类少、方法分散、操作复杂等缺点。因此建立一种同时检测保健食品中多种雌性激素的方法，对保障人体健康、提高生活质量具有重要意义。

  液相色谱 – 质谱联用技术作为新型检测手段不仅具有准确、灵敏、快速等特点，而且适用于基质复杂、干扰严重的痕量化合物的分析检测，在食品安全、药物检测和环境监测等领域广泛应用。目前，国内尚未对保健食品中雌激素和孕激素的检测制定相应的国家标准，笔者建立了高效液相色谱 – 串联质谱法同时测定保健食品中多种雌性激素，对完善保健食品检验标准体系、为市场监管提供技术依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  液相色谱仪：Nexera XR 型，日本岛津公司；三 重 四 级 杆 质 谱 仪：AB SCIEX Triple Quad ™5500 型，配电喷雾离子源 (ESI)，MultiQuant 数据处理系统，美国应用生物系统公司；

  电子分析天平：CPA 225D 型，感量 0.01 mg，德国赛多利斯公司；

  恒温数控超声波清洗仪：KQ–500 GDV 型，北京盈祥科技有限公司；

  甲醇、乙腈：色谱纯，美国霍尼韦尔公司；

  甲酸、氨水：色谱纯，北京盈祥科技有限公司；

  20 种雌性激素标准品：详细信息见表 1 ；

  样品：胶原蛋白维 C 粉，市售；

  实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

  20 种雌性激素标准储备溶液：1 mg／mL，分别精密称取 20 种雌性激素标准品各 0.01 g（精确至0.000 1 g）于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至标线，混匀，于 –18℃下冷冻保存。

  20 种雌性激素系列混合标准工作溶液：分别移取 20 种雌性激素标准储备溶液各 0.5 mL 于 50 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，混匀，配制成 20 种雌性激素质量浓度均为 10 μg／mL 的混合标准工作液。然后用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为 0.04，0.2，0.4，1.0，2.0 μg／mL 的系列混合标准工作溶液。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱仪

色谱柱：Thermo RP–MS 型 (100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美国热电公司 ) ；流量：0.3 mL／min ；柱温：30℃；进样体积：5 μL ；流动相及梯度洗脱程序见表 2。

1.3.2 质谱仪

  离子源：电喷雾离子化源 (ESI) ；监测模式：多反应监测 (MRM) 模式；离子参数见表 3 ；20 种雌性激素的 MRM 条件见表 4。

1.4 样品处理

  称取 1.0 g( 精确至 0.001 g) 样品于 25 mL 容量瓶中，加入适量甲醇，涡旋振荡 5 min，超声提取 20 min 后，用甲醇定容至标线，过 0.20 μm 滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

  采用 Thermo RP–MS 色谱柱对 20 种雌性激素进行分离，结果发现，采用等度洗脱时分离效果较差，因此采用梯度洗脱进行分离。梯度洗脱条件见表 2。

  流动相组成影响化合物的峰形和离子化效率，实验发现，以乙腈为流动相各激素的信号响应优于甲醇，故选用乙腈 – 水体系作为流动相。通过调整梯度洗脱比例，在正离子模式下，水相中加入甲酸有利于目标物的离子化，在负离子模式下加入氨水可以改善色谱峰形、提高灵敏度。为达到最佳的灵敏度，在正离子模式下，在流动相中加入质量百分浓度分别为

1.0%，0.5%，0.2%，0.1% 的甲酸，在负离子模式下在流动相中加入质量百分浓度分别为 1.0%，0.5%，0.2%，0.1% 的氨水，结果表明，在正离子模式下在流动相中加入 0.2% 甲酸，在负离子模式下在流动相中加入

0.2% 的氨水均能达到最佳的灵敏度。

2.2 质谱条件优化

  以乙腈 – 水 ( 体积比为 50∶50) 混合溶液为基准流动相，采用直接进样方式将标准溶液注入离子源，对 20 种雌性激素的 MRM 条件进行优化。在正离子和负离子模式下进行全扫描，结果表明，雌三醇等 9 种激素在负离子电离模式下，可获得较高丰度的［M–H］– 母离子，苯甲酸雌二醇等 11 种激素在正离子电离模式下，可获得较高丰度的［M+H］+ 母离子。根据母离子和响应最高的两组碎片离子进行定性，确定特征母离子和子离子，并对碎裂电压、碰撞能量和离子化温度等质谱条件分别进行优化，20 种雌性激素混合标准溶液正负离子电离模式下总离子流色谱图如图1 和图 2 所示。20 种雌性激素的 MRM 条件见表 4。

2.3 线性方程与检出限

  在 1.3 仪器工作条件下，对系列混合标准工作溶液进行测定，以待测化合物的质量浓度 (x) 为横坐标，以色谱峰面积 (y) 为纵坐标，绘制标准工作曲线。以定量离子大于 3 倍信噪比 (S／N ＞ 3) 对应的浓度作为方法检出限。20 种雌性激素的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表 5。由表 5 可知，己烯雌酚的质量浓度在 0.01～0.7 μg／mL 范围内，其余19 种雌性激素的质量浓度在 0.04～2.0 μg／mL 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于 0.995，方法检出限为 0.01～0.04 mg／kg。

2.4 加标回收与精密度试验

  取空白样品进行加标回收与精密度试验，添加浓度分别为 5，25，50 mg／kg，按 1.4 方法处理样品，在 1.3 仪器工作条件下进行测定，其中加标量为 25mg／kg 浓度水平重复测定 6 次，其余两个浓度水平重复测定 3 次，分别计算平均回收率和加标量为 25mg／kg 时的相对标准偏差，结果见表 6。

  由表6可知，20种雌性激素的平均回收率为 80.3%～114.5%，测 定 结 果 的 相 对 标 准 偏 差 为2.2%～5.8%(n=6)，表明该方法具有较高的精密度和准确度，满足分析要求。

3 结语

  建立了 20 种雌性激素的高效液相色谱 – 串联质谱的分析方法。该方法操作简单，结果准确，灵敏度高，重现性好，能有效提高保健食品中雌性激素的检测效率，对完善保健食品检验标准体系、为市场监管与监督提供技术依据。