玉屏风散出自宋代张松的《究原方》，由黄芪、白术和防风组成，具有益气固表止汗的功效，可以治疗中医学的各种汗证虚症，为中医“扶正固本”的经典名方。现代药理研究表明玉屏风散还具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等方面的功能。

  复方配伍是中医用药最重要的特点之一，复方质量稳定是药物剂量准确的基础和前提。目前市面上中药饮片的来源渠道多、范围广，市售饮片对方剂质量一致性的影响值得探讨。指纹图谱是中药一致性评价、复方解析和研究的主要手段之一，已用于玉屏风散的质量评价。文献报道的玉屏风散水

煎液高效液相色谱指纹图谱因流动相梯度洗脱条件不理想而分离效果欠佳。

  笔者以乙腈 –0.05% 磷酸水为流动相，优化洗脱条件，对市售药材饮片制备的玉屏风散进行色谱分析，利用高效液相色谱指纹图谱技术，从全化学成分的角度探讨市售饮片对该方剂组成一致性的影响，为玉屏风散的质量控制和评价提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  高效液相色谱仪：1260 型，配置四元泵、全自动进样器、DAD 二极管阵列检测器、高效液相色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；

  旋转蒸发仪：EYELA OSB–2100 型，日本东京理化器械株式会社；

  台式离心机：Heraeus Biofuge Primo R 型，美国赛默飞世尔科技有限公司；

  中药指纹图谱相似度评价系统软件：2004A，国家药典委员会；

 乙腈：色谱纯，美国费希尔公司；

 甲醇：色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司；毛 蕊 异 黄 酮 苷（M–020–170926）、升 麻 素 苷（S–004–170827）、 升 麻 素（S–007–170429）、5-O-甲 基 维 斯 阿 米 醇 苷（J–002–170731）、白 术 内 酯 Ⅲ（B–035–160822）、3- 羟 基 -9，10- 二 甲 氧 基 紫 檀 烷（Q–057–171011）对照品：纯度均大于 98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；

  对照药材蒙古黄芪（120974–201612）、膜荚黄芪（121462–201304）、白 术（120925–201611）、防 风（120947–201409）：中国食品药品检定研究院；

  中药材饮片：来源列于表 1，所有饮片均由山东中医药大学张芳副教授鉴定为正品，黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，（炒）白术为菊科植物白术的干燥根茎的麸炒品，防风为伞形科植物防风的干燥根；

实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：Agilent Eclipse XDB–C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；

流量：1 mL／min ；

柱温：30℃；

进样体积：20 μL ；

流动相：以乙腈为流动相 A，以 0.05% 磷酸水为流动相 B，按表 2 所示浓度变化进行梯度洗脱，进样前以初始流动相条件平衡 20 min ；

检测波长：230 nm。

1.3 玉屏风散饮片样品溶液的制备

按照《究原方》中玉屏风散配比，取黄芪饮片 6 g、（炒）白术饮片 6 g、防风饮片 3 g，粉碎，加入 10 倍量纯净水浸泡 30 min，加热回流 40 min，过滤；向药渣中加入 5 倍量纯净水，加热回流 20 min，过滤，合并滤液并混匀，于 40℃浓缩至相当于原药材含量 1.0 g／mL。

取玉屏风散浓缩液 4 mL，置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇至标线，振摇混匀，于 4℃冰箱中放置过夜，将混悬液抽滤，取续滤液，过 0.45 μm 微孔滤膜，得玉屏风散饮片样品溶液。将购自不同药店的10 批饮片，按上述方法制备玉屏风散饮片样品溶液 10 份。

1.4 标准方剂对照溶液的制备

  取对照药材蒙古黄芪 0.2 g、白术 0.2 g、防风 0.1 g，加入 50 倍量纯净水浸泡 30 min，于 60℃超声提取 20 min，过滤；向药渣中加入 25 倍量纯净水，于60℃超声提取 10 min，过滤，合并滤液并混匀，挥干溶剂，向残渣加入 60% 甲醇溶液超声溶解，至药液浓度相当于原药材含量 0.4 g／mL，振摇混匀，于 4℃冰箱中放置过夜，将混悬液以 12 000 r／min 离心，取上清液，得标准方剂对照溶液。

  按上述方法制备膜荚黄芪复方、空白对照溶液对与单味药材溶液。

1.5 对照品溶液的制备

  取毛蕊异黄酮苷、升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、白术内酯Ⅲ、3- 羟基 -9，10- 二甲氧基紫檀烷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制得质量浓度均为 100 μg／mL 的对照品溶液，摇匀，于4℃冰箱中储存备用。

1.6 实验方法

  采用高效液相色谱法按 1.2 色谱条件测定玉屏风散饮片样品溶液、标准方剂对照溶液、空白对照溶液与单味药材对照品溶液，得各复方、药对、单味药高效液相色谱指纹图谱，计算各批玉屏风散样品之间、各批玉屏风散样品与标准方剂之间指纹图谱的相似度，对复方指纹图谱中的主要色谱峰进行归属，探讨市售饮片对玉屏风散质量一致性的影响。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

  采用 DAD 检测器进行 190～400 nm 全波长扫描并考察美国安捷伦科技有限公司生产的两种色谱 柱 Agilent HILIC 色 谱 柱（2.1 mm×100 mm，2.7μm）与 Agilent Eclipse XDB–C18 色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对玉屏风散饮片样品溶液中各成分的分离效果，结果表明前者分离效果差，后者能实现主要色谱峰的分离且色谱峰信息较全。参考文献［11］，以乙腈 –0.05% 磷酸水为流动相，优化梯度洗脱程序，玉屏风散饮片样品溶液中各成分实现较好分离，所得谱图基线平稳、峰形理想。故最终选择Agilent Eclipse XDB–C18 色 谱 柱 与 乙 腈 –0.05% 磷酸水流动相。

2.2 稳定性试验

  取同一玉屏风散饮片样品溶液，分别于制备后 0，2，4，8，12，24 h 进 样 6 次 进 行 分 析。 按 相同方法分析单品药材对照溶液。结果显示，各主要色谱峰的保留时间无明显变化，相对标准偏差为 0.02%～0.18% ；色 谱 峰 面 积 相 对 标 准 偏 差 为0.53%～2.76%（个别色谱峰略高），表明样品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3 精密度试验

  取同一玉屏风散饮片样品溶液，在 1.2 色谱条件下连续进样 6 次进行分析。按相同方法分析单品药材对照溶液。结果显示，各主要色谱峰的保留时间无明显变化，相对标准偏差为 0.01%～0.12% ；色谱峰面积相对标准偏差为 0.62%～2.57%，表明方法的精密度良好。

2.4 重现性试验

  取同一批玉屏风散饮片，按 1.3 方法制备 6 份样品溶液，在 1.2 色谱条件下进样分析。结果显示，各主要色谱峰的保留时间无明显变化，相对标准偏差为 0.01%～0.22% ；色谱峰面积相对标准偏差为0.79%～3%，（个别色谱略大于 3%），表明该方法的重现性良好。

2.5 玉屏风散饮片样品溶液的测定

  在 1.2 色谱条件下测定 10 批玉屏风散饮片溶液、标准方剂溶液、空白对照溶液与单味药材对照溶液，色谱分别如图 1、图 2 所示。

较色谱图，确定了 22 个共有峰，其中 5 号色谱峰与相邻峰分离度较好且峰面积稳定适中，故选其为参照峰（S）。通过与空白对照溶液及单味药材对照溶液指纹图谱比较，确定玉屏风散指纹图谱中色谱峰的药材归属。各共有色谱峰的相对保留时间与相对峰面积见表 3。

将 10 批玉屏风散色谱图原始数据导入“中药指纹图谱相似度评价系统软件（2004A）”，以 S1 为参照谱，利用平均值法计算相似度，计算结果见表4。结果显示，随机选取不同来源的 10 批玉屏风散指纹图谱差异较大，说明市售药材中化学成分含量有较大的差异，影响了药材的品质。

中国药典规定中药黄芪有蒙古黄芪与膜荚黄芪两种正品来源，进一步按 1.4 方法分别制备含蒙古黄芪与膜荚黄芪的标准方剂溶液，建立玉屏风散水提液标准图谱，以 S11 为参照谱，利用平均值法计算各批玉屏风散指纹图谱与标准图谱的相似度，计算结果见表 5。

由表 5 可知，各批玉屏风散饮片指纹图谱与标准方剂指纹图谱相比较，有 6 批相似度低于 0.5，3批在 0.5～0.8 之间，1 批高于 0.9。以标准药材的特征指纹峰为参比，对市售药材制备的玉屏风散进行初步质量评定，随机取样的 10 个药店中，只有一个药店所采购的药材质量令人满意。

3 结语

  高效液相色谱法具有灵敏度高、分析速度快、应用范围广等优点，高效液相色谱指纹图谱技术既能从全化学成分的角度评价中药饮片与复方，又能体现中医整体性的用药特点，方法简便且稳定可靠，该技术在中药质量标准、药效物质基础等方面的研究中具有重要意义。本次分析结果证明了饮片对复方质量的重要影响，药材生长条件、炮制方法等均会影响中药饮片的质量，进而影响复方的质量，控制复方质量是保证中药质量稳定可控、中医治疗安全有效的主要措施。因此，应将高效液相色谱指纹图谱技术应用于中药全面研究，明确中药药效物质基础，实现饮片与方剂的质量可控