一、案例

维生素B₁，又称硫胺素或抗神经炎素，是维生素中发现最早的一种，由嘧啶环和噻唑环结合而成，为无色结晶体，溶于水，在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中不稳定，易被氧化和受热破坏，人体内，维生素B，以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲。维生素B，主要存在于种子的外皮和胚芽中，如在米糠和麸皮中含量很丰富，酵母菌、瘦肉中含量也较丰富。目前所用的维生素B1大多数属于化学合成品。

二、选用的国家标准

GB／T 9695．27—2008肉与肉制品维生素B1含量测定。

三、测定方法

1．试样处理

样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)，避免温度超过25℃，将试样装于密封容器中，防止变化或成分改变，试样应在24h内尽快分析。

2．水解

称取4～6g试样(精确至O.001g)，置于150mL具塞锥形瓶中，加人0.1mol／L盐酸50mL，摇匀，于沸水浴中水解30min，取出，冷却至室温。

3．酶解

用0.5mol／L乙酸钠溶液调节试样水解液，使pH值为4.0～4.5，加入高峰氏淀粉酶溶液(100g／L)5mL，混匀，置于45～50℃恒温箱或水浴中保温3h，取出冷却后用O.1mol／L盐酸调pH值约为3.5，将溶液全部转移至100mL容量瓶中，用水定容，混匀，用滤纸过滤，取滤液备用。

4．净化

吸取酶解滤液25.OOmL，注入人造沸石玻璃色谱柱，控制色谱柱流速约为1mL／min，弃去流出液。用15mL近沸热水分3次洗涤色谱柱，弃去流出液。用20mL 60～80℃热的酸性氯化钾溶液，分5次洗脱维生素B1，收集于25mL容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾溶液定容，混匀备用。

5．氧化

取两支50mL具塞比色管，各加入1.5g氯化钾或氯化钠，再加入5.OmL试样溶液，一支加入3.OmL氧化剂，立即旋摇试管，混匀，随即加入10mL异丁醇萃取，塞上塞子振摇90s，静置分层。另一支试管做空白对照，加入3mL 150g／L氢氧化钠溶液，旋摇混匀，随即加入10.00mL异丁醇溶液萃取，静置分层。异丁醇层用无水硫酸钠脱水。

6．测定

调节荧光激发波长365nm；发射波长435nm；狭缝5mm。取异丁醇萃取液置于比色皿中，测定氧化样品管和空白对照管中溶液的荧光强度。

7．标准溶液的处理和测定

吸取2.OOmL维生素Bl标准工作液，于150mL具塞锥形瓶中，按照上述方法进行水解、酶解、净化、氧化和测定。

8．结果计算

X=I-I0/Q-Q0*20/m*1000*100

式中 X——样品中维生素B1的含量，mg／100g；

I——氧化样管中异丁醇溶液的荧光强度；

I₀——空白样管中异丁醇溶液的荧光强度；

Q氧化标准管中异丁醇溶液的荧光强度；

Qo——空白标准管中异丁醇溶液的荧光强度；

20——2.OOmL 10µg／mL维生素B1标准工作液含维生素B1的量，µg；

m——试样质量，g。

9．试剂

①0.1mol／L盐酸。

②异丁醇。

③氯化钾或氯化钠。

④2mol／L乙酸钠溶液：27．2g三水乙酸钠，溶于水中，定容至100ml。用冰乙酸调pH值为4.5。

⑤高峰氏淀粉酶溶液(100g／L)。

⑥氢氧化钠溶液(150g／L)。

⑦氧化剂：10g／L铁氰化钾1mL，用150g／L氢氧化钠溶液稀释至100mL，用时现配。

⑧酸性氯化钾溶液：250g／L氯化钾1L+8.5mL浓盐酸。

⑨无水硫酸钠。

⑩人造沸石：市售品需经过活化处理。

⑨冰乙酸。

◎酸性乙醇：用0.1tmol／L盐酸调乙醇溶液(乙醇：水一1：4)pH值为3.4～4.3。

⑩维生素B1标准溶液：具体如下。

标准储备液：称取50．Omg维生素B1标准品，置于500ml。棕色容量瓶中，用酸性乙醇溶解并定容，于4℃下保存，此溶液维生素Bl含量为100µg／mL。

标准工作液：吸取标准储备液10mL置于100mL棕色容量瓶中，用酸性乙醇定容，此溶液维生素B1含量为10µg／mL。

10．仪器

①荧光分光光度计。

②人造沸石玻璃色谱柱：将脱脂棉置于玻璃色谱柱中，倾入悬浮于水中的人造沸石高度约为10cm(约用1.5g人造沸石)，洗下储液槽壁上的人造沸石颗粒，在吸附过程中液面要始终高于沸石表面，防止柱内有气泡，色谱柱可控制流速1mL／min。

③培养箱或恒温水浴。