培养基制备、灭菌及无菌检测技术的过程和方法 

     一、实验目的

     1.了解培养基的配置原理

     2.掌握其制备过程和方法

     二、实验原理

     培养基是人们按照不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的需要而配置的营养基质。用于微生物的分离纯化培养鉴定和保存菌种。培养基的种类有很多，按对培养基的组成物质的化学成分是否完全了解可以分为天然培养基和合成培养基。按照不同微生物对营养的要求，选择可被迅速利用的碳源、氮源、无机盐及其他营养成分可制成不同的培养基。

     三、实验器材

     1.牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、NaCI、K2HPO4、KNO3、MgSO4FeSO4马铃、蔗糖、琼脂、10%NaOH和10%HCI。

     2.刻度搪瓷杯、天平、牛角匙、小烧杯、称量纸、分装漏斗、试管、棉花、铁丝筐、电炉、玻棒、纱布。

     四、实验操作

     1.称量：按照培养基配方，准确称取各种成分。

   （1）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基

    牛肉膏  3克     蛋白胨  5克  NaCl 5克         琼脂15-20克  水 1000毫升  PH调至7.2-7.4 0.1MPa压力下灭菌30分钟

   （2）马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）马铃薯  200克  蔗糖(白糖)  20克琼脂 15-20克   水1000毫升去皮洗净的马铃薯按量称取，切成小块，放在水中煮沸，并维持20一30分钟，用双层纱布过滤得马铃薯汁，补足到定量的水。自然pH值0.1MPa压力下灭菌30分钟。

   （3）高氏一号培养基

    可溶性淀粉  20克  KNO3 1克 K2HPO4'3H2O  0.5克  NaCl 0.5克 MgSO4'7H2O 0.5克 FeSO4'7H2OpH调至7.2~~7.4先用少量的水将淀粉调成糊状后再加水和其他的盐类。0.1MPa压力下灭菌30分钟

     2.溶化：

    依配方顺序，用少量的水溶解各成分，有时需加热溶化，最后补足所需水量。在暴沸时添加少量的水抑制沸腾，融化过程需不断搅拌。

    3.调整pH：

    用PH试纸或酸酸度计先试测初制备培养基的的PH值，然后用10%NaOH或10%HCⅠ调整至所需的pH范围。

    4.过滤：

    在配制固体培养基时，事先将琼脂称好用冷水浸泡，洗净挤干后加人液体培养基中，琼脂融化的过程中，需不断搅拌，并控制火力，不要使培养基溢出或烧焦，待完全融化后，补足水分。

    5.分装：根据不同的需要，可将配制的培养基分装在试管或三角瓶内，注意不要将培养基沾染在管口和瓶口上，以免粘住棉塞，引起污染。

    6.装棉塞或硅晈塞，棉塞粗细、长短要求合适，外面再包一层报纸避免造成污染。

    7.灭菌：

    培养基的灭菌时间和温度，需按各种规定进行，保证灭菌数果和不损失培养基的必要成分。灭菌后的培养基要趁热摆成斜面，半固体要垂直放置，待冷却即可成为斜面培养基和半固体深层琼脂培养基，而且必须放在37℃温箱培养24小时，无菌生长方可使用。

    五、注意事项

    1.牛肉膏的称取：

    用玻璃棒蘸取适量牛肉膏，抹于称量纸上，勿取过量，不足时，再蘸取少量，逐步添加；然后将牛肉膏连同称量纸放入水中，稍等片刻牛肉膏即从称量纸上脱落，用玻璃棒将纸捞出即可。

    2.加琼脂：

    琼脂一般应在调好了pH后加入，琼脂的加入不会影响pH，加入琼脂后要控制火力并不断搅拌，以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。加热过程中因水分蒸发而可能使体积减小，应补充水分至所需量。

    3.灭菌前一定要用报纸包扎好。