一、目的要求
1、学习及了解高效液相色谱仪的工作原理及操作要点。
2、掌握高效液相色谱法测定三聚氰胺的原理及方法。
3、学会使用高效液相色谱仪、学会识别色谱图。
4、掌握固相萃取柱的使用方法。
5、了解三聚氰胺的来源、用途和主要危害。
二、实验原理
试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用流动相溶解，用高效液相色谱仪进行测定。
三、实验试剂和仪器
1、试剂
①甲醇：色谱纯。
②乙腈：色谱纯。
③氨水：浓度25％～28％。
④混合型阳离子交换固相萃取柱：60mg，3mL。
⑤三氯乙酸溶液(10g/L)：称取10g三氯乙酸，加水至1000mL。
⑥氨化甲醇溶液：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。
⑦乙酸铅溶液(22g/L)：取22g乙酸铅，用约300mL水溶解后定容至lL。
⑧滤膜：0.45μm，有机相。
⑨甲醇水溶液：50mL甲醇加入50mL水，混匀。
⑩离子对试剂缓冲液：称取2.02g庚烷磺酸钠和2.10g柠檬酸于1L容量瓶中，加水溶解稀释至刻度。
⑪三聚氰胺标准品：纯度＞99％。
A．三聚氰胺标准储备液：称取lOOmg(精确到0.1 mg)的三聚氰胺标准品，用甲醇水溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，该溶液浓度为lmg/mL，于4℃避光保存，有效期3个月。
B．三聚氰胺标准中间液：吸取标准储备液5.OOmL，于50mL容量瓶内，用甲醇水溶液定容至，50mL，该溶液i聚氰胺浓度为lOOμg/L，于4℃避光保存，有效期1个月。
C．三聚氰胺标准工作液：用流动相将三聚氰胺标准中间液逐级稀释得到浓度为1．0μg/mL，5.0μL/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL的标准工作液。
2、仪器
①高效液相色谱仪，配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
②离心机：转速不低于4000r/min。
③涡旋混合器。
④超声波清洗器。
⑤氮气吹干仪。
⑥同相萃取装置。
四、实验步骤
1、提取
称取2.00g试样置于50mL具塞离心管中，准确加入20mL三氯乙酸溶液(10g/L)，加入
2mL乙酸铅溶液(22g/L)，摇匀，超声提取20min。静置2min，以不低于4000r/min离心10min，上层液待净化。
2、净化
分别用3mL甲醇，3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确移取10mL离心液分次上柱，控制过柱速度在1mL/min以内。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。洗脱液500C下氮气吹干，残留物用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。同时做空白实验。
3、高效液相色谱条件
①色谱柱：C8柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度5μm；或性能相当的色谱柱。
②柱温：室温。
③流动相：离子对试剂缓冲液(三、1．⑨)-乙腈(90:10)，混匀。
④流速：1.0mL/min。
⑤检测波长：240nm。
⑥进样量：20μL。
五、结果处理
(8-16)
式中：X——试样中l一聚氰胺的含量，mg／kg；
A——样液中三聚氰胺的峰面积，积分单位；
c——标准溶液中j聚氰胺的质量浓度，μg/mL；
V——样液最终定容体积，mL；
As——标准溶液中三聚氰胺的峰面积，积分单位；
m——试样的质量，g；
f——稀释倍数。
六、注意事项
1、本方法的定量限为2mg/g。
2、回收率：在添加浓度2mg/kg～lOmg/kg浓度范围内，回收率在80％～110％之间，相对标准偏差小于10％。
3、精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值
的10％。
参考资料：食品中有毒有害物质检测
