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HPLC色谱方法开发中保留因子k的深度剖析
作者:中检航标   转载自:   发布日期:2019-06-17

HPLC色谱方法开发中保留因子k的深度剖析


      保留因子作为化合物在液相上保留最重要的参数,同时它在分离度公式中占据重要的一席,因此理解好保留因子对于液相色谱方法开发具有重要意义,下面小编和大家一起剖析下保留因子k。


       1.  k的定义


       保留因子(k):固定相中的溶质分子总量(s)除以流动相(m)中的溶质分子总量得到。当化合物在固定相中溶质分子越多,K值越大,保留时间越长。


       2.  k的计算


      (1)等度洗脱中,运用公式k=(tR-t0)/t0进行计算,其中t0约等于5x10-4Ldc2/F。式中L是色谱柱的长度,以mm为单位;dc是色谱柱的内径,也以mm为单位;F是流动相流速,以ml/min为单位;t0以分钟为单位;其中5x10-4Ldc2为色谱柱的死体积Vm。


       举例来说,对于4.6mm内径的色谱柱,其死体积Vm近似为0.01L,因此对于一根150x4.6mm的色谱柱,如果使用流速为 0.5ml/min,那么t0=Vm/F=1.5/0.5=3分钟;然后根据待测样品的保留时间tR就可以计算出该色谱峰的k值了。


      (2)在梯度洗脱中,条件比较复杂,k值计算公式为0.87tGf/vmΔΦs。其中tG为梯度时间,F为流速,Vm为色谱柱的死体积,ΔΦ为梯度范围,一般分子量为100-500Da的化合物S大约为4,根据此公式我们同样可以计算出梯度洗脱中化合物的k值。


        3. k的使用原则


        在进行HPLC方法开发时一般要求k为1到10,最大容许范围为2-20。在这个范围内我们可以得到又窄又高的色谱峰,同时化合物的分离能够达到最佳。如果k小于1时,化合物的分离就会很差;当化合物的k大于20时候,继续提高k值,化合物的分离度变化十分微小,但是保留时间却增加明显。


        4. k的主要影响因素


       (1)   有机相的比例:


        这个是改变k值的主要首选因素,通常有机相增加10%,会导致样品的色谱峰k值下降大约2.5倍。


       (2)   流动相pH


        这个主要是针对酸碱等离子化合物,比如酸性化合物一般在酸性条件下k值高,在碱性条件下k值低。


       (3)   离子对试剂


        加入离子对试剂也可以改变化合物的k值的保留。


         5. k在方法开发中的应用


         k值的计算主要应用于初始方法开发中,先通过调整流动相中的有机相,使得所测定的化合物的k值在1-10以内。注意这里设定值是1-10,而不是到20,确定这个范围是为了后面方法进行优化的时候能够留有余地;当遇到化合物的分离度不好时,可以牺牲一部分k值进行提高化合物的分离度。但是注意k值不要到达20以上。如果k值在20时化合物的分离度还不符合要求,此时就需要更改一些其他的色谱条件了,不要再一味的进行延长化合物的保留时间了,因为此时延长保留时间对于化合物的分离度已经几乎没有影响了,而且会导致峰型变宽。


         同时在方法开发选择色谱柱的时候也要注意下化合物的k值,当比较不同的色谱柱对化合物分离的影响,一定要使所有的化合物能在一个同一个k值上来进行比较(此时需进行调节有机相的比例来实现),这样才能获得分离化合物最优的色谱柱。


         举例说明分离化合物A和B(B出峰在后),使用氨基柱、氰基柱、C18柱,首先要调节有机相比例使得化合物B的k值在不同色谱柱都在10左右,然后再看各个色谱柱对A和B的分离情况,哪个色谱柱分离最优。


         以上是小编对于保留因子方面的一些理解,可能有些地方理解不对,希望大家给以指正。

 


关键词:酸碱等离子化合物、氨基柱、氰基柱、C18柱、国家标准物质网
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