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超高效液相色谱 – 串联质谱法测定 卷烟中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖
作者:中检航标   转载自:   发布日期:2020-05-29

水溶性糖与烟草品质关系密切,糖在卷烟燃吸 时产生酸性物质,抑制烟气中的碱性物质,平衡烟气 酸碱度,降低刺激性;糖还能与氨基酸发生美拉德反 应,形成多种香气物质,产生令人愉快的香气。此外, 水溶性糖能使烟叶柔软,富有弹性,色泽鲜亮。烟 叶中含糖量过高则会使烟气吃味平淡,浓度和香气 不足,劲头和强度减弱,影响烟叶的燃烧性,使阴燃 变差,燃烧不完全1–2。研究表明,影响烤烟水溶性 总糖和还原糖含量的主要因素有品种、栽培措施3和生态环境4–6等,而片烟陈化对两糖含量也有一 定影响7–8。总糖与还原糖均与烟叶感官评吸质量 显著正相关9,对降低刺激性、消除杂气、增强感官 柔细度有显著贡献10。另外两糖含量还显著影响 烤烟香型特色彰显度,总糖正向直接影响中间香型 特色彰显度,还原糖负向直接影响中间香型特色彰 显度11,其中总糖对中间香型烤烟烟气成分的贡献 较大12。烟草行业一般采用连续流动分析仪测定 水溶性总糖和还原糖的百分含量,但每种糖的含量 则无从知晓。目前测定果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖 等水溶性糖的方法主要有离子色谱法13、气相色谱 14–15、液相色谱示差折光检测法16–17、液相色谱 蒸发光散射检测法18–21等。其中,离子色谱法对样 品的分析效率相对较低;气相色谱法需要样品衍生 化才能测定,相对繁琐;液相色谱差折光检测法对 温度敏感,稳定性相对较差;液相色谱蒸发光散射 检测法的选择性稍差。超高效液相色谱 串联质谱 法具有分析效率高,选择性好,灵敏度高的优势,非 常适合样品的高通量分析,然而目前尚无超高效液 相色谱 串联色谱测定卷烟中水溶性糖的文献报 22–23。笔者建立超高效液相色谱 串联质谱法 测定云产卷烟中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 4 种水 溶性糖的含量,该方法利用样品中水溶性糖含量较 高的特点,采用高倍稀释以降低基质效应,无需采用 固相萃取对样品进行净化处理,该方法样品分析速 度更快,准确度更高。另外,根据水溶性糖的含量 对云产卷烟进行聚类分析,以期为烟草加工、卷烟配 方、卷烟产品开发与维护等提供技术支持。 

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪:Waters Acquity 型,美国沃 特世公司; 串联质谱仪:Waters Quattro Premier 型,美国沃 特世公司; 超声波清洗机:JP–080 型,40 kHz,深圳洁盟清 洗设备有限公司; 超纯水机:Milli-Q 型,德国默克密理博公司; 台式离心机:5804 型,德国艾本德公司; 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵:色谱纯,美国飞世尔 科学世界公司; 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品:纯度均 大 于 99.0%CAS 号 分 别 为 57–48–750–99–757– 50–169–79–4,西格玛奥德里奇 ( 上海 ) 贸易有限 公司;卷烟样品:40 种,产地为云南,市售。

1.2 溶液配制

分别称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品各 0.100 0 g 4 100 mL 容量瓶中,用纯水定容至标 线,配制成 4 种水溶性糖的质量浓度均为 1 mgmL 的单一标准储备液。然后移取葡萄糖和果糖单一标 准储备液各 1 mL 1 10 mL 容量瓶中,用体积 浓度为 50% 的乙腈定容至标线,得葡萄糖和果糖的 质量浓度均为 100 μgmL 的混合储备液;移取蔗 糖和麦芽糖单一标准储备液各 1 mL 1 100 mL 容量瓶中,用体积浓度为 50% 的乙腈定容至标线, 配制成蔗糖和麦芽糖的质量浓度均为 10 μgmL 的混合储备液,于 4℃保存,备用。 分别移取上述两种混合储备液 0.250.51.01.5 2.02.53.0 mL 1 10 mL 容 量 瓶 中,用 50% 乙腈定容至标线,配制成葡萄糖和果糖的质量 浓度均为 2.551015202530 μgmL,麦芽糖 和蔗糖的质量浓度均为 0.250.51.01.52.02.53.0 μgmL 4 种水溶性糖的系列混合标准工作 溶液。

1.3 样品处理

取出烟支中的烟丝,用旋风磨粉碎,过 850 μm 筛,即得烟末样品。称取 25 mg 烟末于 50 mL 离心 管中,加入 25 mL 水,超声提取 30 min,取 1.5 mL 取液以 12 000 rm 离心 5 min,移取上清液 1 mL50% 乙腈稀释至 10 倍体积,待测。 1.4 仪器工作条件 1.4.1 色谱条件 色谱柱:Acquity BEH Amide (100 mm×2.1 mm1.7 μm,美国沃特世公司 ) ;流动相:A 相为 水,B 相为乙腈,两相均加入 0.1% 体积的氨水;流量: 0.15 mLmin ;柱温:30℃;进样体积:2 μL ;梯度 洗脱程序见表 1

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1.4.2 质谱条件

质谱电离方式:负离子模式;监测方式:多反应 监测 (MRM) ;喷雾电压:3 000 V ;雾化气流量:750 Lh ;辅助气流量:50 Lh ;离子源温度:120℃。 4 种水溶性糖的质谱参数见表 2

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2 结果与讨论 

2.1 样品处理方法的选择

烟草中水溶性糖的提取一般采用的提取液有 纯水13162250% 乙腈溶液1455% 乙腈溶液1870% 乙腈溶液19215% 的乙醇溶液20。以纯水 超声提取即可满足检测要求,既简便又节约了有机 溶剂。烟草中水溶性糖含量较高,多倍稀释后可有 效减小基质效应,因此样品采用纯水超声 30 min萃取液稀释 10 倍后直接进样分析。

2.2 质谱条件的优化

通过质谱外接针泵,采用流动注射方式,以 20 μLmin 1.0 μgmL 4 种水溶性糖的单一标准 溶液分别注入质谱检测器中,在电喷雾负离子模式 下,以每种糖的分子离子峰为母离子进行二级质谱 扫描,选择丰度较高的 2 个碎片离子作为特征离子, 以强度最大的作为定量离子,另外一对作为辅助定 性离子,然后对每种糖的定量离子和定性离子的锥 孔电压和碰撞能量等质谱参数进行优化,使定量离 子与定性离子的离子对强度达到最大,从而得到每 种糖的最佳质谱检测参数见表 2。 

2.3 色谱条件的优化

在相同的梯度洗脱条件下,比较了甲醇和乙腈 的分离效果,结果表明,使用甲醇 水为流动相洗脱 时,4 种水溶性糖的保留时间较短,色谱峰形较好, 但葡萄糖与果糖、蔗糖与麦芽糖难以实现基线分离。 由于这两组糖的组分互为同分异构体,有相同的母 离子和子离子,所以分离难度较大。使用乙腈 为流动相洗脱,4 种糖可达到基线分离。降低水相 初始比例则出峰推迟,葡萄糖、麦芽糖出现严重的峰 分叉;降低流量有利于消除葡萄糖、麦芽糖峰分叉。 由于葡萄糖、麦芽糖等还原性糖会产生旋光异构, 这些异构体在有些色谱条件下会被分离,这种现象 在酸性或自然条件下较易出现。向流动相中加入碱 性调节剂后,糖的旋光异构会消失,并且糖带有多羟 基,在碱性条件下易于离子化22,在流动相中加入 0.1% 的氨水后,4 种水溶性糖的色谱图见图 1。由 1 可知,各组分色谱峰形对称,分离度较好。

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2.4 线性方程与检出限

1.4 仪器工作条件下对 4 种水溶性糖的系列 混合标准工作溶液进行测定,以各组分的质量浓度 为横坐标(x),色谱峰面积为纵坐标(y)绘制标准工 作曲线。根据最小检测浓度的 3 倍相对标准偏差、 前处理的样品质量、提取体积和稀释倍数等计算方 法检出限194 种水溶性糖的线性范围、线性方程、 相关系数及检出限见表 3。由表 3 可知,4 种水溶性 糖的质量浓度在各自的线性范围内(葡萄糖和果糖 的线质量浓度为 2.530 μgmL,麦芽糖和蔗糖的 质量浓度为 0.253 μgmL)与色谱峰面积具有良 好的线性关系,相关系数均大于 0.997,方法检出限 0.03 mgg,满足分析要求。

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2.5 精密度试验

取已知 4 种水溶性糖含量的样品,按照 1.3 法处理,在 1.4 仪器工作条件下平行测定 6 次,测定 结果见表 4。由表 4 可知,测定结果的相对标准偏 差为 0.7%2.9%,表明该方法的精密度较高。

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2.6 加标回收试验 

取已知 4 种水溶性糖含量的样品,分别进行低、 中、高 3 个水平的加标,在 1.4 仪器工作条件下平行 测定 6 次,测定结果见表 5

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由表 5 可知,在 3 个添加水平上,样品的平均回 收率为 93.6%101.0%,说明该方法的准确度较高。

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关键词:卷烟;果糖;葡萄糖;国家标准物质平台,标准物质平台
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